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国外科学家研究手持式PCR仪技术获突破

助工
2017-01-18 16:37:37    评分

近期,范德堡大学的科研团队提出一种新方法——“适应性 PCR”(adaptive PCR),有望革新传统的 PCR 技术,并为手持式PCR仪带来可能。相关研究成果以 “Adaptive PCR based on Hybridization Sensing of Mirror-Image L-DNA” 为题发表在《Analytical Chemistry》期刊。

PCR 的反应过程包含 个基本步骤,依次为:变性(高温环境下模板 DNA 发生变性,由双链变成单链)、退火(低温环境下引物与单链按碱基互补配对的原则结合)、延伸(温度回升至最适宜后,DNA 聚合酶开始合成互补链)。至此获得两条精确复制地 DNA 双链。随后,PCR 反应将进入 “变性—退火—延伸” 的循环,获得更多的半保留复制链,30-40 个循环可以获得几百万倍的基因数量。

由此可见,温度和样本是实现 PCR 的关键因素。基于聚合酶制造的 PCR 仪实际上是一个温控设备,需要控制变性、复性和延伸的温度。室温的变化、样本化学成分的改变都会影响 PCR 反应。所以,实验人员可能需要经过多次试验优化出最佳的样本配比、最高效的温度设置。

尽管技术成熟,PCR仪器操作复杂且对样本的化学成分及反应环境高度敏感,这主要是因为没有最直接的方法从分子水平监控反应过程。

为了实现精准控制,范德堡大学的生物医学工程师 Nicholas Adams 和 Frederick Haselton 将 “开箱即用” 的理念应用于 PCR,并提出“适应性 PCR”(adaptive PCR)的新方法。他们利用左旋 DNAL-DNA)监测、控制 PCR 反应。

左旋 DNA 是 DNA 分子的镜像,其物理特性与右旋 DNA 一样,但是它不参与大多数生物反应。因此,当带有荧光标记的左旋 DNA 被添加至 PCR 样本中,它会以相同的方式(变性、退火)提供荧光信号反映分子反应信息、

为了验证他们的设想,Adams 和 Haselton 联合物理系助理教授 William Gabella 一起创建了一个适应性 PCR 设备原型(如下图),并进行相关验证试验。

手持式 PCR 仪:左边是紫外激光器,由它照射中间的样本,右边的分光光度计负责检测样本中荧光水平的变化,从而控制 DNA 复制过程。

Adams 表示:“现有的 PCR 仪器非常挑剔。我们实验室配备有 台 PCR 仪。当我们将相同的样本放入 台仪器中,只有两台仪器正常工作。当我与仪器公司的技术人员反映这一问题时,她询问我仪器周围是否有八英尺厚的墙壁?我回复说是的。她解释是因为这堵墙干扰了气流,从而对仪器运行造成影响。当然,事实证明她是对的,因为当我把仪器移出来,它又开始正常工作了!

技术人员对一系列可能的问题提出应对之策:仪器需放置在温度可控的房间;DNA 样本需要纯化…… 即便如此,它仍然需要实验人员耗费时间优化反应条件。

现在,适应性方法能够控制 PCR 过程,有望简化操作、提高准确性、降低其对环境的敏感性,减少仪器大小(从台式到手持)。

适应性 PCR 借助荧光标记的左旋 DNA 确定理想的变性和退火温度,从而规避了所有变量。

左旋 DNA 序列可以通过商业合成获得,其序列与需要扩增的 DNA 序列一样,而且左旋 DNA 的两条链上分别标记上一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团(当两条链完整时,淬灭基团会吸收报告基团发出的荧光信号)。

伴随着高温环境,左旋 DNA 也会发生变性变成单链,使得荧光报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。通过分析荧光信号的累积速度,研究人员可以确定所有双链分离的精确时间点。

同时,我们还需要合成左旋引物(标记有荧光淬灭基团)。当 PCR 反应进行至退火步骤,引物会与左旋 DNA 单链集合,其淬灭基团会抑制荧光信号。这时候,荧光信号又会发生变化,从而便于研究人员分析引物与所有 DNA 单链结合的时间点。

值得注意的是,左旋 DNA 的量并不会改变,因为它不参与扩增步骤。

研究人员表示,这一适应性 PCR 技术可以弥补传统 PCR 仪器的局限性,它可以让基于 PCR 的诊断有机会脱离实验室环境,例如样本制备的高标准、反应温度的严密控制。



专家
2017-01-18 21:28:02    评分
2楼

生物工程技术


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